Protein Hizmetleri


Protein Sentezi

Laboratuvarımızda protein üretimi ve saflaştırma için temel olarak E. coli bakterisinin M15 suşunu kullanmaktayız. Bu suş iki farklı plazmid ile çalışmaktadır. Bu plazmidlerden biri bakteriyel ekspresyon vektörü olan pQE diğeri ise proteinin kontrollü olarak üretilmesini sağlayan pREP4 plazmididir. pQE plazmidleri istenilen proteini kodlayan bölgenin amino veya kabroksil ucunda 6 histidin amino asidinden oluşan HisTag kodlayan bölgeyi içerir. Bu sayede rekombinant olarak istenilen protein amino veya karboksil ucunda HisTag içerir. HisTag büyük miktarda üretilen proteinin saflaştırılmasını sağlar. Bunun için NiNTA içeren agaroz kolonlar kullanılarak affinite kromatografisi uygulanır.

pREP4 plazmidi ise lacR üreterek ve normal koşullarda pQE plazmidindeki ilgili bölgelere bağlanarak pQE plazmidinden mRNA üretimini engeller. Bu şekilde bakterinin büyütülmesi pQE vektöründe içerdiği genden üretilecek proteinin etkisinden bağımsız olarak gerçekleştirilebilmektedir. Bakterinin protein üretmesi için büyüme evrelerinden lag phase içerisindeyken ortama laktoz analoğu olan IPTG eklenerek lacR'ın etkisiz kalması sağlanır. Bu sayede lacR pQE üzerindeki ilgili bölgelere bağlanamaz ve pQE plazmidinin içerdiği genden protein üretimi sağlanmış olur. Bu şekilde protein üretimi istenilen durumda tetiklenerek gerçekleştirilebildiği için maksimim miktarda saf protein elde edilebilmektedir.

Ayrıca bakteriler için toksik olabilen bazı proteinlerin bu sayede maksimum miktarda üretimi sağlanmış olur. Üretilen proteinin saflaştırılmasında NiNTA ile konjuge edilmiş agaroz küreciklerden oluşan resin kullanılmaktadır. Saflaştırılmak istenilen proteindeki HisTag Nikel atomlarına affinite gösterir ve geri döndürülebilir şekilde bağlanır. Sonrasında kolon birkaç defa yıkandıktan sonra pH'ın kademeli olarak düşürülmesiyle kolona HisTag aracılığıyla bağlı olan protein kolondan ayrılır ve saf olarak elde edilir.

Bu aşamada saf protein miktarını maksimum tutabilmek için denatüre saflaştırma protokolü uygulanır. Ancak üretilecek ve saflaştırılacak proteinin 3 boyutlu yapısını doğru olarak kazanması önemliyse veya sonrasında fonksiyonel deneyler yapılacaksa protein native olarak üretilip sağlaştırılmak istenebilir. Bu durumda da NiNTA'e affinitesi daha yüksek olan imidazol kullanılarak ve danatüre ajanlar kullanılmadan saf protein elde edilebilir.

Bazı özel uygulamalar için saflaştırılacak proteinin disülfid bağlarının gerektiği gibi oluşabilmesi için özel enzimler (chaperon gibi) içeren protokollerin uygulanması gerekmektedir. Bu protokolleri de laboratuvarımızda bulunan ve bu amaçlara yönelik özel olarak tasarlanmış kitleri olan in vitro translation cihazımız ExiProgen ile ihtiyaç halinde uygulayabilmekteyiz. Ayrıca bazı proteinlerin bakteri için son derece toksik olmasına bağlı olarak E. coli'de üretimleri imkansızdır. Bu tür problemlere yine ExiProgen'i kullanarak maksimum miktarda üretim ve saflaştırma sağlayarak çözüm sunmaktayız.




İn vitro Translasyon

In vitro translasyon Proteinlerin hücresiz (cell-free) ortamda ifade edilmesi olup moleküler biyoloji uygulama araçları arasında önemli bir yere sahiptir. In vitro translasyon işlemleri; gen ürünlerinin hızlı tanımlanması, protein katlanma çalışmaları, konak hücreye toksik olan ve rekombinant metotlar ile üretilmesi güç olan protein ürünlerinin üretimi ve karakterizasyonu, modifiye ya da doğal olmayan aminoasitlerin uzayan peptid zinciri içine dahil edilmesi, proteolitik parçalanma, çözünmeyen inklüzyon cisimcikleri gibi yapılar oluşturabilecek proteinlerin ifadesi gibi çalışmalarda kullanılmaktadır.

Prensip olarak in-vitro translasyon; herhangi bir hücre populasyonundan ekstrakt hazırlanmasına olanak sağlamakta ve herhangibir mRNA’nın trasnlasyonunu mümkün kılmakla beraber pratikte in-vitro translasyon için pek az hücre tipinden ekstrakt hazırlanabilmektedir. Genelde ökaryotlar için tavşan retikülositleri prokaryotlar için ise E.coli gibi yüksek protein sentez seviyesine sahip hücrelerden hazırlanmaktır.

Genellikle büyük miktarlarda protein üretimi için E.coli çok sık kullanılan bir mikroorganizmadır. Ancak bazı proteinler E.coli’ye toksik oldukları için bu proteinlerin E.coli’de üretimi ya çok sınırlı olabilmekte ya da mümkün olmamaktadır. Ayrıca E.coli’de protein üretimi için proteinin üretileceği genin proteini kodlayan kısmının özel olarak PCR ile çoğaltılması ve pQE vektörleri gibi bakteriyel ekspresyon vektörlerine klonlanması gerekmektedir. Bu aşamalar en az 3 gün sürmektedir. Oysaki laboratuvarımızda mevcut olan Bioneer firmasının ExiProgen cihazı in-vitro traslation kitleri ile protein kodlayan gen bölgesini içeren PCR ürünü veya plazmid ile standart olarak 6 saatte 100 mikrograma kadar 16 ayrı saf protein üretebilmektedir. Bu cihazın kitlerinde in-vitro protein üretimi için E.coli hücre lizatı kullanılmaktadır. Ayrıca alternatif olarak 3 saatte 20 mikrograma kadar 24 ayrı saf protein veya daha büyük çaplı kitlerimiz ile 500 mikrograma kadar 8 ayrı saf protein üretmek mümkündür.

Üretilen proteinler HisTag ile işaretli olarak üretilmektedir. Ancak üretilen protein istenirse HisTag işaretinden ayrılmış olarak da elde edilebilir. ExiProgen ile disülfit bağları içeren proteinler de doğru 3 boyutlu yapıda üretilebilmektedir. Bunun için özel olarak geliştirilmiş kit ile üretilmiş 2-9 arası disülfit bağ içeren proteinlerin fonksiyonel oldukları aktivity assay ile gösterilmiştir. ExiProgen ayrıca farklı kitleri ile çeşitli kaynaklardan genomik DNA ve RNA saflaştırma da yapabilmektedir

Western Blotlama

Western blot hizmeti kapsamında laboratuvarımızda BioRad’ın dikey jel elektroforezi, semi-dry ve wet transfer, görüntüleme ve dokümantasyon sistemleri ve sarfları kullanılmaktadır. Rutinde SDS-PAGE’de kullanılan jeller laboratuvarımızda üretilmektedir. İsteğe bağlı olarak hazır jel de kullanılmaktadır. Western blot kapsamında çeşitli uygulamaların yapılması mümkündür. Örneğin çalışılan hücre lizatında ilgilenilen proteinin üretim düzeyi kontrol edilebilir. Ayrıca üretilmiş ve saflaştırılmış bir proteinin saflığı ve kimliği kontrol edilebilir. Bunlara ek olarak serumda olması beklenen antikorların varlığı ve miktarı da Western blot ile ölçülebilir.

Western blot kapsamında araştırmacılardan örneklerle birlikte spesifik antikorlar da temin edilebileceği gibi bunları laboratuvarımız da sağlayabilir. Western blot hizmeti kapsamında deneye ek olarak sonuçların yorumlandığı detaylı rapor da sunulmaktadır.






Antikor Geliştirme

Yakında araştırma çalışmalarında kullanılmak üzere farelerde birincil ve ikincil antikorlar geliştirilecektir. Western blot, ELISA, MesoscaleTM, immünohistokimya ve immünofloresans deneylerinde kullanılabilecek antikorlar kısa sürede elde edilecektir. İhtiyaç duyulan antikorlar monoklonal ya da poliklonal olarak üretilebilecektir. Talep edildiğinde antikorlar western blotta taranıp etkinlikleri test edilecek ve garantili şekilde sunulacaktır. Birincil antikoru üretmek için gereken antijen ya da vektör, araştırmacı tarafından temin edilebileceği gibi, ek ücret karşılığında Sentegen tarafından da sağlanabilecek, aşılama sonrası elde edilen antikor ise serum olarak ya da saflaştırılmış biçimde gönderilecektir.

Siparişi takiben ilk antikorun gönderilmesi tahmini olarak monoklonal antikorlar için 10-12 hafta, poliklonal antikorlar için 6-8 hafta ve saflaştırılmamış serum içinse 5-6 haftadır. Ancak antijenik molekülün immünojenitesi düşük olduğu takdirde veya antijen/vektör Sentegen tarafından geliştirilir ya da sağlanırsa bu süre uzayabilir.


Q-dot Antikor Konjugasyonu

Kuantum Dot – antikor konjugatları özellikle in-vitro uygulamalarda geniş yer bulmaktadır. Bu uygulamalara örnek olarak Western blot, çeşitli amaçlara yönelik protein array taramaları, immünohistokimya ve immünositokimya verilebilir. Bu uygulamalarda kullanılmak istenen antikorun siparişi veya sağlanması halinde konjugasyon hizmeti verilmektedir. Konjugasyonda kullanılacak Kuantum Dot’lar rutin olarak UV/mavi(472 nm) ile uyarılan ve kırmızı (625 nm) ışık saçan Kuantum Dotlardır ancak özel amaçlar için farklı dalga boyunda ışık saçan Kuantum Dotlar da konjugasyonda kullanılmaktadır. Bu kapsamdaki dalga boyu kullanıcı tarafından belirlenebilmektedir. Konjugasyon işlemi 24 saatte tamamlanmakta ve aynı gün kargo ile müşteriye gönderilmektedir. Konjugasyonu yapılan antikorun kontrolü için Western blot / Dot blot hizmeti ayrıca verilmektedir.

ELISA

Laboratuvarımızda hem direct hem de indirect ELISA hizmetleri verilmektedir. Bu kapsamda çok sayıda optimizasyon ve istatistiksel analiz yapma tecrübemiz mevcuttur. ELISA protokollerinin ticari kitlerin temini ile uygulanmasını yapabildiğimiz gibi kendimiz de isteğe bağlı bir ELISA protokolü geliştirebilmekte ve optimize edebilmekteyiz. ELISA sonuçlarının değerlendirildiği bir teknik analiz raporu da ELISA hizmetimiz kapsamında sunulmaktadır. Bu kapsamda standart eğri oluşturulması, antikor titrasyon ölçümü, sitokin/kemokin veya herhangi bir protein seviye ölçümü, otolog antikor seviye ölçümü, Monte Carlo analizleri ile eşik değer belirleme ve çeşitli istatistiksel testler ile hassasiyet ve özgüllük belirleme çalışmaları yapabilmekteyiz.